喜樹堿多功能納米顆粒有效實現了乳腺癌治療療效與維持腸道穩態之間的平衡

喜樹堿多功能納米顆粒有效實現了乳腺癌治療療效與維持腸道穩態之間的平衡

喜樹堿（CPT） 是一種有效的化療藥物，對包括乳腺癌在內的多種癌癥都有活性。在臨床試驗的初始階段，CPT 被配制成 CPT 鈉鹽，以在生理 pH 值下實現其非活性羧酸鹽形式 （CPT-Na） 和活性內酯形式 （CPT） 之間的微妙平衡。然而，這些試驗中納入的患者表現出劑量依賴性骨髓抑制、出血性膀胱炎和重度GAE（包括腹瀉、惡心和嘔吐），導致治療停止。直到發現其獨特的抑制 DNA 拓撲異構酶的抗腫瘤機制，CPT 才在抗腫瘤研究中重新受到重視。從 CPT 結構開發的衍生物，如伊立替康和拓撲替康，提高了水溶性并減輕了相關的 GAE。然而，盡管有這些改善，GAEs的發病率仍然很高，這嚴重影響了患者的生活質量。重要的是，這些衍生物的抗腫瘤活性低于 CPT ，這可能會影響治療效果，甚至危及患者的生命。

新型納米藥物遞送系統利用納米材料的特性，使水不溶性藥物在水中具有出色的分散性、延長循環時間、腫瘤靶向能力以及在腫瘤內的顯著積累。此外，某些納米材料具有固有特性，如光熱和光動力效應，可以有效增強抗腫瘤治療的療效。這些納米材料特性為提高CPT 的治療效果同時最大限度地減少不良反應提供了有希望的機會。在過去的二十年里，已有超過 15 種納米藥物被批準用于臨床。此外，幾種基于 CPT 的納米藥物已進入臨床試驗，其中基于 CPT 的抗體藥物偶聯物 （CPT-ADC） 尤其值得注意。然而，實現一個以正確比例平衡這三個部分的公式對科學家來說是一個挑戰。基于光熱療法的聯合療法旨在增強 CPT-ADC 的腫瘤靶向性，從而有效提高這種腫瘤治療的療效并減少潛在的副作用。在以前的研究中，我們的研究小組利用美國食品和藥物管理局批準的試劑普魯士藍 （PB） 來設計和合成用于腫瘤靶向的 PCRHN。PB 的光熱效應的結合增強了 CPT 的抗腫瘤功效，該系統減輕了重要器官的不良反應。然而，之前報道的 CPT 的 GAE 沒有在該系統中進行調查。考慮到 CPT 的強 GAE以及化療誘導的 GAE 可能導致劑量減少、治療周期縮短甚至停藥，這可能導致化療失敗并對患者生命構成威脅，有必要研究 PCRHNs 的 GAE。

大量研究表明，化療誘導的GAE 與胃腸道微環境的改變有關，其中腸道屏障和微生物群起著至關重要的作用。腸上皮細胞和緊密連接蛋白之間的相互作用導致腸道屏障的形成，這對維持腸道穩態至關重要。該屏障隔離腸道內的腸道微生物群，從而防止有害物質穿過并調節腸道通透性。當化療藥物抑制快速增殖的腫瘤細胞時，腸上皮細胞由于其增殖周期短、生長速度快而容易受到藥物的攻擊，從而導致腸道損傷。該過程主要導致腸道通透性增加和腸上皮細胞凋亡，腸道緊密連接蛋白減少，導致化療引起的腹瀉。

腸道屏障的損傷通常會導致腸道微生物群組成的改變。腸道微生物群對食物的分解為腸道細胞提供能量和營養，而腸道中的某些微生物可以提高化療的敏感性并減輕不良反應。然而，某些腸道微生物與化療的毒副作用有關。此外，化療藥物可以直接影響腸道微生物群并導致生態失調。這包括腸道微生物多樣性和豐度的減少，以及微生物組成從更“有益”的共生微生物（如雙歧桿菌和乳酸桿菌）轉變為更“致病”的微生物（包括梭菌和腸桿菌科）。腸道菌群的菌群失調可能導致粘膜炎，從而加劇癌癥的臨床病程。

腸道屏障和微生物群在人體生理學和病理學中起著重要作用，但化療藥物納米物質化對這些過程的影響仍然知之甚少。在先前研究的基礎上，我們進行了一項比較研究，以評估PCRHNs 和不同劑量的游離 CPT 的治療效果，以及它們對腸道屏障功能和微生物群的影響。這項研究為納米藥物對 GAE 的影響提供了有價值的見解，從而為評估納米藥物的安全性奠定了基礎。

PCRHN 的表征

根據我們之前的研究，我們制備了PCRHNs 。PCRHN 的平均直徑為 164 ± 0.3 nm （圖 1接下來，研究了納米顆粒的形態，如圖 1B.PCRHN 的粒徑和形態與先前研究中報道的相似 。此外，PCRHNs 表現出良好的穩定性。即使在鹽水中孵育數天后，PCRHN 也沒有顯示出任何聚集跡象，并且 PDI 值只有很小的變化，這一發現得到了支持。通過研究在存在和不存在 GSH 的情況下 PCRHN 釋放 CPT 來驗證納米顆粒對還原條件的敏感性。如圖 1C，在無 GSH 的情況下，CPT 的釋放速率較慢。然而，在 GSH （5.0 mmol/L） 存在下，CPT 以相對較快的速度釋放，并在48小時后達到 80% 的釋放。許多研究表明，腫瘤細胞中的細胞內GSH濃度可以達到2-20 mM，比細胞外基質中的GSH濃度高100-1000倍，比正常組織中的GSH濃度高7-10倍。這些結果表明，與游離 CPT 相比，PCRHNs 表現出更慢且更穩定的釋放速率，同時還表現出響應腫瘤細胞內 GSH 的快速釋放 CPT 的能力。隨后檢查了 PCRHN 的光熱特性。紅外熱圖像 （圖 1D） 和光熱加熱曲線 （圖 1E） 顯示 PCRHNs 和 PB NPs 在 808 nm 激光照射下的溫度升高沒有顯著差異。此外，即使經過 5 次照射和冷卻循環后，PCRHNs 的溫度仍保持一致，表明具有出色的光熱穩定性 （圖 1F）. 這些發現與以前的研究一致。

體內抗腫瘤活性

研究表明，在平衡化療治療乳腺癌的有效性和毒性方面存在挑戰。先前的研究表明，PCRHNs 對治療乳腺癌有效。然而，對 PCRHNs 治療引起的 GAE 發生率的研究有限 。本研究旨在比較 PCRHNs 與高劑量 CPT 治療的療效和 GAEs，給藥時間表如下圖 2一個。結果表明，5 mg/kg 和 8 mg/kg CPT 的治療效果顯著優于 2 mg/kg CPT，表明游離 CPT 以劑量依賴性方式抑制腫瘤生長。圖 2B 和 C，圖 S3）。通過觀察腫瘤細胞凋亡 （圖 2D） 和增殖 （圖 2然而，5 mg/kg 和 8 mg/kg CPT 治療的治療效果顯著低于 PCRHNs + 激光治療組 （CPT 濃度為 2 mg/kg）。此外，在鹽水或 PCRHNs + 激光處理組的心臟、肝臟、脾臟、肺或腎臟的 H&E 染色切片中未觀察到組織形態或炎性細胞浸潤的明顯改變（圖 S4）。這些發現表明，與高劑量游離 CPT 療法相比，PCRHNs + 激光療法可以獲得卓越的治療效果。

體外和體內腸道屏障

根據其抗腫瘤療效，我們研究了PCRHNs、PCRHNs + 激光治療和不同劑量的 CPT 對腸道屏障的影響。增加劑量的 CPT 導致緊密連接的 Caco-2 細胞逐漸松動，細胞邊界越來越模糊。然而，PCRHNs 處理組和鹽水組之間 Caco-2 細胞的形態沒有顯著差異 （圖 3此外，Caco-2 細胞的免疫熒光染色顯示，緊密連接蛋白 ZO-1 （圖 3B）、Occludin （圖 3C） 和 Claudin-1 （圖 3D） 隨著 CPT 劑量的增加而降低。然而，PCRHNs 處理組和生理鹽水組之間這些緊密連接蛋白的表達沒有顯著差異。

在體外評估腸道屏障后，我們繼續對腸道屏障進行體內評估。首先，我們發現從治療的第4 天到第 8 天，接受 8 mg/kg 劑量的小鼠體重減輕的百分比顯著大于其他治療組（圖 4給藥后第 5 天，8 mg/kg 組小鼠在肛門處表現出糞便粘附和盲腸和結腸中大量液體的積累，而其他組未觀察到此類現象（圖 4隨后，我們在第 7 天進行了一項腸道通透性研究，這是腸道粘膜損傷的指標，是評估腸道屏障完整性的關鍵參數。我們發現，與劑量為 8 mg/kg 的自由 CPT 治療相比，PCRHNs + 激光治療導致血管中 FITC-葡聚糖的暴露量顯著降低（圖 4C）。用 8 mg/kg CPT 處理的小鼠表現出最短的結腸長度 （圖 4D 和 E）。隨后，我們研究了腸道細胞凋亡，以進一步評估不同治療組之間的腸道損傷程度。這些發現表明，與其他治療組相比，高劑量 CPT（5 mg/kg 和 8 mg/kg）的給藥導致結腸上皮中 TUNEL 陽性細胞增加 （圖 4研究表明，腫瘤細胞抑制的療效與給藥藥物的劑量呈正相關;然而，較高的劑量可能會引起脫靶效應，如毒性。本研究表明，高劑量 CPT 誘導的脫靶效應會導致腸道損傷的發生。

此外，我們對結腸中緊密連接蛋白的分布和表達進行了比較分析。ZO-1、Occludin 和 Claudin-1 是在腸道內建立緊密連接的關鍵蛋白，在維持腸道穩態中起著至關重要的作用。免疫熒光分析顯示 ZO-1 蛋白水平無顯著差異 （圖 5A）、Occludin （圖 5B） 或 Claudin-1 （圖 5C） 在 PCRHNs、PCRHNs + 激光和鹽水中。然而，這些蛋白質在用高劑量游離 CPT （5 mg/kg 和 8 mg/kg） 處理的小鼠的腸道中顯著低于 PCRHNs、PCRHNs + 激光和鹽水組。此外，PCRHNs + 激光組 ZO-1、Occludin 和Claudin-1 的表達模式和 mRNA 水平顯著高于高劑量 CPT 治療組 （圖 5）這些發現與免疫熒光分析獲得的結果一致。

這些發現表明，高劑量的CPT 可以增加腸道通透性，誘導腸上皮細胞凋亡，減少腸道內緊密連接蛋白的分布和表達，從而對腸道組織造成顯著損害。與高劑量 CPT 相比，PCRHNs + 激光療法在保持腸道屏障功能的完整性方面具有更大的優勢。

腸道菌群的調節

我們之前的研究結果表明，化療藥物對腸道微生物群的影響因劑量而異，腸道微生物群與治療結果之間可能存在相關性。在這項研究中，我們分析了暴露于不同治療的小鼠的腸道微生物群組成，序列數據已存入國家生物技術信息中心（NCBI） 序列讀取檔案 （SRA） 數據庫，登錄號為 PRJNA1136424。為了評估各種治療對腸道微生物群的影響，我們利用 Bray-Curtis 分析進行基于 OTU 的 PCA。PCA 結果顯示，8 mg/kg 游離 CPT 小鼠和其余組 （圖 6之后，我們檢查了腸道微生物群的多樣性和豐度。與其他組相比，多樣性 （圖 6B） 和豐度 （圖 6C） 8 mg/kg 治療組腸道菌群顯著降低。PCRHNs + 激光治療組腸道菌群多樣性低于 PCRHNs 組（圖 6B)。然而，兩組之間的豐度沒有顯著差異 （圖 6）。據報道，腸道菌群的多樣性和豐度與疾病的發生和治療有關，較高的多樣性和豐度可能有助于患者的健康。

對屬水平微生物群組成的進一步分析顯示，8 mg/kg CPT 處理組 Escherichia-Shigella 的豐度顯著增加 （圖 6D 和 E）。這種細菌能夠穿透上皮細胞并誘導巨噬細胞釋放 IL-1β，從而進一步觸發腸道炎癥。乳酸菌的豐度隨著 CPT 劑量的增加而降低。令人驚訝的是，PCRHNs 組乳酸菌的相對豐度顯著低于 PCRHNs + 激光組 （圖6D和F）。乳酸菌屬是革蘭氏陽性、兼性厭氧或微需氧細菌，作為益生菌廣泛用于各個領域。隨后進行 LEfSe 分析，LDA 評分為 4，以比較 PCRHNs 組和 PCRHNs + 激光治療組在物種水平上確定重要的生物標志物。我們發現羅伊氏乳桿菌是富含 PCRHNs + 激光治療組 （圖 6G 和 H）。這種細菌是一種兼性厭氧微生物，通過對抗感染、減輕炎癥、增強免疫力和促進腸道穩態來促進人類健康。

8 mg/kg 治療組與其他治療組之間的腸道菌群存在顯著差異，這使我們推測高劑量 CPT 是否抑制了某些細菌的生長。為了證實這一假設，通過與 CPT 溶液的體外共培養研究了不同濃度的 CPT 對細菌羅伊氏乳桿菌、大腸桿菌和志賀氏菌的影響。當同一細菌暴露于 PCRHN 或不同濃度的 CPT 時，觀察到的細菌菌落數量沒有顯著變化 （圖 7A 和 B）。然而，在相同濃度的 CPT 下，羅伊氏乳桿菌產生的菌落比大腸桿菌和志賀氏菌屬少。鑒于上述發現，我們假設 8 mg/kg 治療組小鼠腸道微生物群中埃希氏菌-志賀氏菌的富集可歸因于細菌生長速率。隨后，測量了這些細菌的生長速率，結果顯示大腸桿菌和志賀氏菌的生長速率明顯快于羅伊氏乳桿菌 (圖 7C).

研究表明，伊立替康是CPT 的衍生物，可增加腸道通透性并導致腹瀉 。診斷為腹瀉性腸易激綜合征的患者通常表現為結腸運輸增強、腸道微生物多樣性減少和腸桿菌科水平升高。此外，Cheng等人證明，一些補充的細菌能夠占據以前由人類腸道微生物群成員占據的生態位。在本研究中，與上述報告類似，我們觀察到在 8 mg/kg 的劑量下小鼠腸道通透性顯著增加（圖 4C）. 通透性的這種增加導致大量液體流入腸腔 （圖 4B） 導致小鼠腹瀉。同時，高頻率的腹瀉導致多樣性 （圖 6B） 和豐度 （圖 6C） 腸道微生物群。此外，在本研究中，在 8 mg/kg 治療組中觀察到埃希氏菌-志賀氏菌的富集 （圖 6D 和 E）。基于這些實驗結果以及不同劑量 CPT 對羅伊氏乳桿菌、大腸桿菌和志賀氏菌體外生長的影響，我們懷疑高劑量的 CPT 可能會引發腹瀉，同時降低腸道微生物載量。此外，特定微生物（如埃希氏菌-志賀氏菌）的快速增殖可能使它們占據其他微生物留下的生態位。

除了不同劑量的CPT 誘導的腸道菌群變化外，我們還觀察到 PCRHNs 治療組和 PCRHNs + 激光治療組之間的腸道菌群差異。PCRHNs + Laser 組乳酸菌豐度顯著大于 PCRHNs 組 （圖 6D–F、圖 6G），這些物種是兼性厭氧或微需氧細菌，作為益生菌廣泛用于各個領域。PCRHNs + 激光治療似乎促進了兼性厭氧菌和微需氧細菌的生長。

為了驗證這一假設，我們再次進行了實驗，比較了PCRHNs 和 PCRHNs + 激光治療對腸道菌群的影響，序列數據已存入SRA 數據庫，登錄號為 PRJNA1136405。與第一個實驗類似，PCRHNs + 激光組的乳酸菌豐度顯著大于 PCRHNs 組（圖 S5）。LEfSe 分析顯示臺灣乳桿菌 （Acinetobacter towneri， L.） 富集。PCRHNs + 激光組中的 reuteri、Staphylococcus succinus 和 Actinobacillus capsulatus（圖 S6）。L. taiwanensis ， A.towneri ， L.reuteri 和 S.琥珀菌屬被歸類為兼性厭氧菌，而 A.莢膜被歸類為需氧細菌。值得注意的是，這些細菌都不是專性厭氧菌。

對PCRHNs + 激光組中兼性厭氧菌和需氧菌的富集很感興趣，我們隨后進行了分析以確定這種現象的根本原因。腫瘤組織和細胞的過氧化氫水平明顯高于正常組織和細胞。此外，PB NPs在50℃的最佳溫度下表現出催化過氧化物酶活性。研究表明，結腸的微生態環境主要由專性厭氧菌居住。基于上述證據，我們懷疑激光照射會在腫瘤部位誘導局部熱療，從而加速過氧化氫向氧氣的轉化并增加全身氧水平。這最終促進了兼性厭氧菌和需氧菌的生長。

為了驗證這一假設，我們進行了相關的體內和體外實驗。氧氣可以將脫氧血紅蛋白轉化為含氧血紅蛋白（HbO₂)。我們評估了HbO₂腫瘤值，并發現PCRHNs + 激光組顯著大于 PCRHNs 組 （圖 8A 和 B）。隨后，我們對 PCRHNs 和 PCRHNs + 激光組的氧氣產生進行了體外研究，同時監測整個過程中的溫度波動。我們發現，在環境溫度下，PCRHNs 和 PCRHNs + 激光組之間的氧氣產生沒有顯著差異 （圖 8C），并且在此過程中未觀察到溫度的顯著變化 （圖 8我們小組之前進行的研究發現，濃度為 0.02 mg/mL 的 PCRHNs 溶液在激光照射下沒有明顯的加熱。在本研究中，PCRHNs + Laser 組 （PCRHNs 濃度為 0.005 mg/mL） 在體外制氧過程中未觀察到顯著溫度變化，這可能歸因于 PCRHNs 濃度低。由于 PCRHNs + 激光組小鼠的腫瘤溫度在 NIR 激光照射 5 min 后迅速升高至 52.8℃，我們通過在水浴中逐漸升高系統的溫度并在此過程中監測氧氣產生，在體外模擬了這一過程。值得注意的是，在 PCRHN 存在的情況下，氧氣產生量隨著加熱的進行而迅速增加 （圖 8這些發現與以前的報道一致，后者表明確定PB NPs的過氧化氫酶活性的最佳溫度為50℃）。

這些研究表明，乳酸菌在PCRHNs + 激光組中富集，這可能是由于快速激光照射誘導的腫瘤部位加熱。這導致過氧化氫酶活性增加，導致腫瘤內通過催化轉化為氧氣的過氧化氫增加，最終導致氧含量總體增加。這些因素有利于兼性厭氧菌（如乳酸菌）和需氧菌的增殖。

原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2452199X24003153?via%3Dihub