脂質體STAT3降解PROTAC前藥通過化學重編程腫瘤干細胞促進抗肝癌免疫

肝細胞癌（HCC）是全球最常見的原發性肝癌之一，但其治療受到腫瘤微環境（TME）中癌癥干細胞（CSC）的挑戰。CSC是具有干細胞樣特性的惡性細胞，包括自我更新和分化潛力，被認為是HCC治療的有希望的靶點。信號轉導和轉錄激活因子3（STAT 3）對于維持CSC的干細胞性和耐藥性至關重要。然而，由于（1）中等的STAT 3抑制效率和（2）STAT 3信號在正常和惡性細胞中普遍存在，仍然沒有臨床上批準的STAT 3抑制劑。因此，需要替代的CSC靶向STAT 3抑制選項來提高抗HCC療效。

方案一.STAT3降解脂質體PROTAC前藥的構建及其抗CSC機制對肝癌療效的影響

因此，本文報道了一種用于hcc相關CSCs化學重編程的PROTAC stat3降解前藥脂質體。導致有效的CSC抑制，同時增強抗腫瘤免疫(方案1)。von Hippel - LindauE3連接酶結合片段(VL)的脯氨酸羥基位置被硫酮(TK)連接物籠住，并使用OEG連接物進一步連接到STAT3結合域(inS3)。允許在活性氧(ROS)上調的CSCs中按需激活PROTAC。進一步優化OEG連接體的長度和柔韌性，增強STAT3泛素化作用。將inS3-TEG-VL-TK摻入crgd修飾的陽離子脂質體(Lip)中，以促進整合素αvβ3過表達的CSCs對其的吸收和介導溶酶體逃逸以促進它們與細胞質STAT3的相互作用。

圖1.（A，C）inS 3-TEG-VL的二維和三維化學結構。（B、D）由STAT 3、inS 3-TEG-VL和VHL形成的三元復合物的晶體結構的模擬分子模型。(E)三元復合物中STAT 3（D鏈）和VHL（A鏈）的對接結構的LigPlot+圖(F)用具有不同中間接頭的PROTAC處理后，在HCC相關的CSC中STAT 3豐度的WB測定。(G)CLSM評價用具有不同中間接頭的PROTAC處理后細胞STAT 3豐度。（J，K）Lip和Lip@inS3-TEG-VL-TK的TEM圖像。（L，M）Lip和Lip@inS3-TEG-VL-TK的大小分布。(N)Lip@inS3-TEG-VL-TK在含10%FBS的PBS中兩天的流體動力學直徑和多分散性指數（PDI）的變化。(O)Lip、inS 3-TEG-VL-TK和Lip@inS3-TEG-VL-TK的紫外-維斯吸收比較分析。(P)不同處理后inS 3-TEG-VL-TK脫老化的動力學特征。(Q)H2 O2介導的inS 3-TEG-VL-TK脫籠的HPLC分析。

inS3-TEG-VL-TK由于其高載藥量和低免疫原性而被整合到crgd修飾的陽離子脂質體中，以促進靜脈給藥。掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)成像(圖1H?K)顯示脂質體呈均勻球形，且呈球形高度單分散，平均直徑約為100 nm，這與動態光散射(DLS)結果一致，該結果顯示脂質體的平均直徑約為103 nm。有趣的是，inS3-TEG-VL-TK負載導致脂質體顏色從白色變為淺黃色，表明PROTAC成功結合。紫外-可見(UV - vis)吸收光譜顯示，Lip@

inS3-TEG-VL-TK與原始脂質體相比，在266、332和435 nm處出現了前藥特征峰，證實了PROTAC的負載，相對負載能力和效率分別為5.8%和88.6%。

圖2.（A，D）與不同樣品孵育6和12小時后的hepa 1 -6衍生的CSC的CLSM圖像。I：在S3-TEG-VL-RDM中，II：在S3-TEG-VL-RDM中的唇緣。（B，E）圖（A）和（D）中熒光數據的統計分析。（C，F）不同處理后，hepa 1 -6來源的CSC中RDM熒光強度的流式細胞術分析。(G)CLSM圖像顯示了在不同時間點Lip-inS 3 TEG-VL-RDM的溶酶體逃逸效率。I：在S3-TEG-VL-RDM中，以及II：在S3-TEG-VL-RDM中的唇緣。（H，I）在不同時間點，inS 3-TEG-VL在溶酶體和細胞質中的相對分布。(J)在腫瘤細胞中用于重復性STAT 3降解的inS 3-TEG-VL再循環示意圖。(K)Western blot分析不同濃度的inS 3-TEG-VL作用后STAT 3和p-STAT 3的表達。(L)與不同樣品孵育后STAT 3和p-STAT 3表達的蛋白質印跡分析。(M)通過免疫共沉淀法檢測PROTAC處理的CSC中STAT 3的泛素化狀態。(N)STAT 3免疫熒光在肝癌相關性CSC中的變化。(O)不同處理后干細胞樣hepa 1 -6細胞形成的腫瘤球狀體中STAT 3蛋白的免疫熒光。

為了確定脂質體是否能促進CSCs對PROTAC的攝取，用羅丹明(RDM)標記inS3-TEG-VL片段的VL進行體外跟蹤。共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)顯示，hepa1-6衍生的CSC更有效地吸收Lip@inS3-TEG-VL-TK-RDM(圖2A,B,D,E)，流式細胞術顯示，在孵育12小時后，其量比inS3-TEG-VL-RDM增加了4倍。同時，我們還對脂質體進行了FITC標記，以檢測其靶向csc的作用。用crgd修飾脂質體處理hepa1-6衍生和huh7衍生的CSCs，其FITC沉積比不含crgd的脂質體強3倍以上，證實脂質體可以提高PROTAC靶向csc的遞送效果。

圖3.(A)不同處理后CSC蛋白質組學變化的熱圖。(B)Lip@inS3-TEG-VL-TK處理后干細胞樣Hepa 1 -6細胞中蛋白質組學變化的火山圖。(C)定量分析Lip@inS3-TEG-VL-TK處理后關鍵蛋白（表達水平的變化。(D)用不同樣品處理干細胞樣Hepa 1 -6細胞后，對STAT 3、p-STAT 3、CD 44、CD 133、Sox 2、C-myc、Cyc D1、MMP 2和VEGF進行WB分析。(E)與不同樣品孵育后，對HCC相關CSC的傷口愈合試驗。細胞STAT 3水平通過免疫熒光染色來說明。(F)不同處理對干細胞樣Hepa 1 -6細胞侵襲能力的影響。(G)圖（E）中不同組的相對間隙面積的比較分析。(H)根據Transwell實驗對CSC的侵入能力進行定量分析（F）。(I)MTT法檢測干細胞樣Hepa 1 -6細胞與不同樣品孵育24 h后的活力。I：對照，II：Lip，III：Lip@inS3，IV：Lip@inS3-TEG-VL，和V：Lip@inS3-TEG-VL-TK。(J)PROTAC通過選擇性降解STAT 3介導HCC相關CSC化學重編程機制(K)干細胞樣Hepa 1 -6細胞經不同處理后的存活率。(L)流式細胞術分析不同樣品處理后干細胞樣hepa 1 -6細胞的活力。（M?Q）不同處理后CSC/脾細胞共孵育系統上清液中關鍵細胞因子（包括IFN-γ、TNF-α、IL-10、TGF-β和CXCL-10）的分泌水平。

   上述證據證實，脂質體介導的hepa1-6來源的CSCs中STAT3缺失依賴于內源性蛋白酶功能的動員。事實上，基于無標記定量質譜的蛋白質組學分析顯示，脂質體PROTAC藥物前治療誘導STAT3和STAT3信號網絡中的其他標記物，包括VEGF、Sox2、CD44、而在其他非靶向信號通路中未引起顯著改變，表明其能夠特異性抑制CSCs中的STAT3信號通路。

圖4.（A，D）通過尾靜脈注射后，I：Lip@inS3-TEG-VL-TK-Cy 5和II：Lip-cRGD@ inS 3-TEG-VL-TK@Cy5的全身分布的熒光成像。（B，E）全身給藥后小鼠主要器官中的脂質體分布。（C，F）圖（B）和（E）中的定量熒光分析。(G)體內處理過程示意圖。(H)干細胞樣hepa 1 -6-luc細胞引發的皮下腫瘤小鼠在不同處理后腫瘤進展的生物發光分析。(I)各種處理后取出的腫瘤照片。(J)給藥期間小鼠腫瘤體積的變化。(K)各種處理后小鼠體內提取腫瘤的重量。(L)荷瘤小鼠經不同處理后的生存曲線。(M)在用不同樣品處理后，由干細胞樣Hepa 1 -6-luc細胞引發的腫瘤中，STAT 3、p-STAT 3、細胞干性標記物（CD 44、CD 133、C-myc和Sox 2）、轉移標記物（VEGF和MMP 2）和關鍵細胞周期蛋白途徑標記物（FoxM 1、NANOG和細胞周期蛋白D1）的表達的蛋白質印跡分析。(N)Ki 67、H&E、TUNEL染色檢測腫瘤組織中的凋亡細胞。

進一步在體內評價Lip@inS3-TEG-VL-TK的治療效果。本研究首先通過Cy5標記研究脂質體全身給藥后的藥代動力學特性。與原始Cy5(2小時)相比，配方脂質體的血液循環半衰期明顯延長，約為7小時，這有利于促進PROTAC在腫瘤中的積累。還研究了脂質體PROTAC前藥對干細胞樣hepa1-6-luc腫瘤細胞致瘤小鼠的抑瘤作用。不含PROTAC的脂質體未能抑制腫瘤生長，最終腫瘤體積為1.72 cm3，再次突出了脂質體載體的生物相容性。通過對PROTAC前藥脂質體體內抗腫瘤機制的研究，分析其在腫瘤組織中的生化變化。WB分析顯示Lip@inS3-TEG-VL-TK顯著抑制腫瘤內生性STAT3豐度和磷酸化水平，同時下游細胞干性標志物(CD44、CD133和Sox2)、轉移標志物(VEGF和MMP2)和細胞周期蛋白通路標志物(FoxM1、NANOG和cyclin D1)明顯下調。定量聚合酶鏈反應(qPCR)分析顯示，Lip@inS3-TEG-VL-TK不影響STAT3的mRNA水平，但能有效抑制STAT3所有下游標記物的mRNA水平(圖S34)，再次證實脂質體PROTAC前藥通過介導ups介導的降解來促進STAT3的敲低。

圖5.(A)雙側腫瘤模型的給藥方案。(B)不同治療后遠端腫瘤的目視比較。(C)各種處理后取出的遠端腫瘤的重量。(D)不同治療后遠端腫瘤的大小變化。(E)干細胞樣肝癌細胞經不同處理后肺轉移的生物發光分析。(F)圖（E）中腫瘤大小的定量分析。（G?I）DC（CD 80/CD 86）和CD 8 + T細胞（CD 4/CD 8和CD 8/IFN-γ）腫瘤浸潤的流式細胞術評價。(J)流式細胞術檢測Foxp 3 + Treg細胞的腫瘤浸潤。（K?N）通過流式細胞術（n = 3）對圖（G?J）中所示數據進行統計分析。(O)不同處理后肺組織H&E染色。(P)各種治療后肺轉移結節的數量。

在攜帶雙側csc源性腫瘤的小鼠中，研究了PROTAC介導的hcc相關csc的化學重編程的免疫刺激益處。lip處理小鼠的原發和遠端腫瘤均表現出快速生長，最終體積和重量分別約為1.27 cm3和1.4 g，表明其無法激發抗腫瘤免疫。ELISA檢測結果顯示Lip@inS3-TEG-VL-TK組遠端腫瘤中TNF-α和IFN-γ水平上調280%和150%，IL-10和TGF-β水平下調71.3%和72.5%。這表明PROTAC介導的CSC重編程成功地激發了全身抗

腫瘤免疫，從而抑制腫瘤遠端生長。

本文研究開發了一種用于HCC治療的stat3降解脂質體PROTAC前藥，該前藥對HCC相關CSCs進行重編程，以抑制其干性特征，同時激發抗腫瘤免疫，從而在體內顯著抑制HCC。脂質體載體允許CSCs有效攝取PROTAC前藥，并促進其溶酶體逃逸;之后，它們被過量的ROS激活，觸發ups依賴性STAT3降解。脂質體PROTAC前藥在體內有效抑制HCC的生長和轉移，副作用可忽略不計，為提高HCC治療療效提供了高度模塊化的方法。

Nano Lett.

https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.4c00201