靶向維生素B3代謝重編程作為化療耐藥癌癥的納米治療策略

癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)促進(jìn)癌癥干細(xì)胞(CSC)介導(dǎo)的化療耐藥和免疫抑制腫瘤微環(huán)境。然而，直接消耗CAFs可能會(huì)增加癌癥的侵襲性和轉(zhuǎn)移。作為一種針對(duì)化療耐藥癌癥的通用策略，Gemini -樣同型靶向納米顆粒(NPs)被設(shè)計(jì)用于雙管齊下的CAFS轉(zhuǎn)化和癌細(xì)胞消除。在對(duì)各自的一線化療藥物耐藥的乳腺癌、肝癌、胰腺癌和結(jié)直腸癌小鼠模型中，單劑量水凝膠共同遞送Gemini-like NPs可以恢復(fù)化療敏感性，誘導(dǎo)免疫激活，并實(shí)現(xiàn)腫瘤消退。此外，它還能刺激強(qiáng)健的T細(xì)胞記憶，長(zhǎng)期具有抗腫瘤效果。因此，這項(xiàng)研究代表了一種具有廣泛適用性的創(chuàng)新方法來(lái)克服癌癥化療耐藥性。

首先，癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)是腫瘤微環(huán)境(TME)中活化的基質(zhì)細(xì)胞，在癌癥進(jìn)展中具有關(guān)鍵功能。它們產(chǎn)生纖維化的細(xì)胞外成分，形成物理屏障，損害藥物外顯性，限制免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。近年來(lái)的研究表明，CAFs在癌癥治療中有更多的不良反應(yīng)。例如，CAFs構(gòu)成癌癥干細(xì)胞(CSC)生態(tài)位的核心成分，分泌白細(xì)胞介素6 (il - 6)和il - 8來(lái)維持和富集CSC，并隨后誘導(dǎo)化療耐藥。此外，腫瘤基質(zhì)中的CAFs通過(guò)產(chǎn)生多種趨化因子，包括用于趨化吸引髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs)的C-X-C基序趨化因子配體1 (CXCL1)和C-C基序趨化因子配體2 (CCL2)，幫助產(chǎn)生免疫抑制性TME。CXL12和CCL5募集調(diào)節(jié)性T (Treg)細(xì)胞。但直接消融CAFs可促進(jìn)CSC擴(kuò)散，增強(qiáng)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，從而降低生存率。因此，旨在將活性CAFs重編程為靜止?fàn)顟B(tài)的微調(diào)治療是開(kāi)發(fā)新治療方法的一種有吸引力的策略，特別是對(duì)于化療耐藥癌癥。

細(xì)胞代謝是由多種代謝酶介導(dǎo)的，在決定細(xì)胞命運(yùn)和功能中起著至關(guān)重要的作用。腫瘤細(xì)胞具有獨(dú)特的代謝特性，如對(duì)糖酵解和脂質(zhì)代謝的能量依賴性增加。乳酸和脂肪酸在TME中的積累顯著改變了浸潤(rùn)免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的代謝通量和隨后的行為。因此，通過(guò)干擾關(guān)鍵的代謝調(diào)節(jié)因子來(lái)重塑TME似乎是增強(qiáng)當(dāng)前治療策略的一個(gè)有吸引力的選擇。煙酰胺是維生素B3 (VB3)的一種形式，是細(xì)胞生成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的前體甲基轉(zhuǎn)移酶煙酰胺n -甲基轉(zhuǎn)移酶(NNMT)在包括脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞、癌細(xì)胞和CAFs在內(nèi)的幾種類型的細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，為VB3代謝提供了另一種途徑。NNMT催化煙酰胺甲基化開(kāi)始降解，消耗s -腺苷蛋氨酸(SAM)中的一個(gè)活性甲基。在過(guò)表達(dá)NNMT的細(xì)胞中，NAD+和SAM的細(xì)胞質(zhì)儲(chǔ)存庫(kù)都縮小了。鑒于SAM和NAD+分別在組蛋白/DNA甲基化和組蛋白去乙酰化中的基本作用，它們的缺乏將導(dǎo)致基因表達(dá)的廣泛變化。因此，調(diào)節(jié)NNMT水平可能通過(guò)表觀遺傳調(diào)控將VB3代謝重編程與細(xì)胞功能重塑結(jié)合起來(lái)。納米顆粒(NP)介導(dǎo)的核酸和藥物遞送為基因表達(dá)調(diào)控提供了一種很有前途的策略。在本研究中，我們觀察到培養(yǎng)的CAFs表達(dá)的NNMT水平遠(yuǎn)高于典型的癌細(xì)胞系，從而設(shè)計(jì)了一種以CAFs為靶點(diǎn)的NNMT調(diào)節(jié)NPs，作為克服乳腺癌、肝癌、胰腺癌和結(jié)直腸癌等四種腫瘤模型化療誘導(dǎo)耐藥的通用工具。以介孔二氧化硅NP (MSN)為核心構(gòu)建了兩種Gemini-like NPs，并將其裝載到TMEre響應(yīng)水凝膠中，對(duì)CAFs和癌細(xì)胞進(jìn)行雙管齊下的治療。CAFS靶向NPs (siNNMT-CAFS, siNNMT-MSN@CAFS膜的簡(jiǎn)稱)被CAFS膜包裹以傳遞NNMT短干擾RNA，而癌細(xì)胞靶向NPs (Chemo-CC，ChemoMSN@cancer細(xì)胞膜的簡(jiǎn)稱)被同型癌細(xì)胞膜偽裝，用于輸送相關(guān)的一線化療藥物(圖1a)。siNNMT-CAFS對(duì)NNMT水平的下調(diào)可重新編程CAFs中異常的VB3代謝，并重建SAM和NAD+的細(xì)胞池。這些代謝變化通過(guò)改變組蛋白甲基化和去乙酰化誘導(dǎo)基因表達(dá)譜的表觀遺傳調(diào)控，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)類似于正常成纖維細(xì)胞，并降低了可能促進(jìn)化學(xué)耐藥和免疫抑制的CAFs分泌因子的水平。siNNMT-CAFS治療有效地減少了腫瘤內(nèi)的CSC、MDSC和Treg細(xì)胞群，并增加了細(xì)胞毒性CD8+ T細(xì)胞的募集。與Chemo-CC聯(lián)合使用時(shí)，兩種類型的Gemini-like NPs協(xié)同作用，觸發(fā)腫瘤抑制的epi免疫化療療效(圖1b)。作為概念的證明，單劑量的水凝膠共同遞送Gemini-like NPs可以實(shí)現(xiàn)化療耐藥的完全消退并賦予長(zhǎng)期的T細(xì)胞記憶，以保護(hù)治愈的小鼠免受腫瘤的再次攻擊。這種基于VB3代謝重編程的CAFs靶向策略為克服癌癥化療耐藥提供了一種創(chuàng)新的視角，具有廣泛的適用性。

圖1：用于化學(xué)抗性癌癥的水凝膠遞送的Gemini樣NP的方案。

首先，CAFs可以通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1 (TGF-B1)從NIH/3T3成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，形成星狀形態(tài)，并獲得α -平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和成纖維細(xì)胞激活蛋白- α (FAP- rp)等生物標(biāo)志物。

通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射(DLS)和zeta電位測(cè)量，負(fù)載負(fù)電荷siNNMT后，MSNs的水動(dòng)力直徑增加(82.6±4.0 nm vs 106.4±8.5 nm)，表面電荷減少(36.9±1.5 mV vs 12.7±2.3 mV)。暴露于RNA酶后，游離siRNA容易被降解。通過(guò)透射電子顯微鏡成像，CAFS膜或4T1癌細(xì)胞膜涂層成功，顯示出明顯的核/殼結(jié)構(gòu)(圖2a)。膜涂覆后，顆粒大小siNNMT-CAFS和EBN-4T1進(jìn)一步增加，分別達(dá)到136.6±4.2 nm和125.3±4.4 nm。此外，細(xì)胞膜涂層導(dǎo)致siNNMT - MSN和ebn - MSN表面電荷的逆轉(zhuǎn)。siNNMT - CAFs和EBN-4T1的zeta電位分別為- 16.5±1.7 mV和- 12.5±1.4 mV(圖2b)。接下來(lái)，我們探討了CAFs或癌細(xì)胞是否優(yōu)先攝取雙子座樣NPs。我們用siNNMTFAM-CAFS和EBN-4T1的1:1混合物孵育CAFs或4T1細(xì)胞進(jìn)行共聚焦熒光成像。事實(shí)上，CAFs內(nèi)部化了類似雙子座的NPs，并優(yōu)先考慮siNNMTFAM-CAFS。相反，在4T1細(xì)胞中，febn -4T1的攝取占主導(dǎo)地位(圖2c)。流式細(xì)胞術(shù)也證實(shí)了這些觀察結(jié)果，表明這兩種類型的nps可以通過(guò)同型靶向不同地進(jìn)入CAFs和癌細(xì)胞(圖2d)。CAFs中的VB3代謝重編程和染色質(zhì)重塑NNMT消耗甲基供體SAM以阻止VB3轉(zhuǎn)化為NAD+。我們推斷，通過(guò)siNNMT-CAFS降低NNMT水平可以恢復(fù)SAM和NAD+的細(xì)胞池，這隨后誘導(dǎo)組蛋白甲基化和去乙酰化的變化，從而抑制CAFs的致癌表型(圖2e)。我們?cè)u(píng)估了與siNNMT-CAFS孵育的CAFs的代謝變化。NNMT的敲除提高了細(xì)胞中NAD+和SAM的水平，表明這種納米藥物可以恢復(fù)正常的維生素B3代謝和甲基供體池(圖2f,g)。由于SAM和NAD+分別在組蛋白甲基化和組蛋白去乙酰化中起著關(guān)鍵作用，我們進(jìn)一步探索了與siNNMT-CAFS治療相關(guān)的組蛋白修飾的表觀遺傳變化。免疫印跡分析結(jié)果顯示，siNNMT-CAFS處理細(xì)胞中三甲基化組蛋白H3賴氨酸4 (H3K4Me3)和賴氨酸27 (H3K27Me3)水平大量升高，乙酰化組蛋白H3賴氨酸9 (H3K9Ac)水平明顯降低(圖2h)。我們還監(jiān)測(cè)了CAFs中促癌細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，包括增強(qiáng)癌細(xì)胞干細(xì)胞性的IL6和IL8，誘導(dǎo)MDSC分化的CXCL1和CCL2，以及促進(jìn)Treg細(xì)胞募集的CCL5和CXCL12。表觀遺傳重塑siNNMT-CAFS導(dǎo)致上述基因明顯的轉(zhuǎn)錄抑制(圖2i;)。總之，這些數(shù)據(jù)證實(shí)了我們的假設(shè)，即siNNMT-CAFS可以通過(guò)一系列代謝和表觀遺傳重塑誘導(dǎo)CAFs向靜止成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變。

圖2：Gemini-like NPs的表征。

由于siNNMT-CAFS在CAFS靶向和CAFS重編程方面的潛力，我們進(jìn)一步評(píng)估了siNNMT-CAFS@Gel在化療耐藥4T1三陰性乳腺癌(TNBC)小鼠模型中的療效（圖3a，b）。一劑siNNMT-CAFS@Gel導(dǎo)致耐藥4T1腫瘤的CAFs中nnmt_水平大幅下調(diào)(圖3c)。因此，我們觀察到腫瘤組織中Cscs、MDSCs (CD45+CD11b+Gr-1+)和Treg細(xì)胞(CD45+CD4+CD25+Foxp3+)的豐度明顯下降(圖3d - f)。此外，免疫抑制細(xì)胞數(shù)量的減少導(dǎo)致TME中cd45 +CD8+ T細(xì)胞的浸潤(rùn)增加(圖3g)。這些結(jié)果表明，siNNMT-CAFS@Gel對(duì)TME的重塑促進(jìn)了CSC的分化和免疫激活，可能分別恢復(fù)了腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物和宿主免疫監(jiān)視的敏感性。

圖3：Gemini-likeNPs的遞送和TME重塑。

隨后，通過(guò)Gemini-like NPs聯(lián)合治療化療耐藥TNBC接下來(lái)，我們測(cè)試了聯(lián)合遞送兩種Gemini-like NPs (siNNMT-CAFS/EBN-4T1@Gel)或遞送任一種NPs的治療效果。在接種耐藥4T1細(xì)胞7天后，給藥單劑量無(wú)載或載np的水凝膠(圖4a)。通過(guò)生物發(fā)光成像實(shí)時(shí)跟蹤腫瘤進(jìn)展顯示，siNNMT-CAFS@Gel或EBN-4T1@Gel組癌細(xì)胞信號(hào)略有減少，而siNNMT-CAFS/EBN-4T1@Gel組信號(hào)逐漸消失(圖4b)。從腫瘤生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析中也觀察到類似的結(jié)果，共給藥組的所有小鼠腫瘤完全消融(圖4c)。值得注意的是，siNNMT-CAFS/EBN-4T1@Gel組的所有小鼠都恢復(fù)并保持健康，沒(méi)有腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的跡象(圖4d)。我們進(jìn)一步分析了每組腫瘤中的CSC和免疫細(xì)胞群。siNNMT-CAFS@Gel和siNNMTCAFS/EBN-4T1@Gel將CSC和免疫抑制細(xì)胞群減少到相當(dāng)水平，表明共孵育組TME重塑的影響主要?dú)w因于siNNMT-CAFS對(duì)CAFS的重編程(圖4e-g)。此外，所有治療組均顯示血清中用于吸引CD8+ T細(xì)胞的CXCL-9水平、浸潤(rùn)的CD8+ T細(xì)胞水平以及CD8+ T細(xì)胞分泌的干擾素和顆粒酶B (GZMB)水平升高，其中siNNMTCAFS/EBN-4T1@Gel組效果最顯著(圖4h)。上述數(shù)據(jù)提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，表明兩種Gemini-like NPs通過(guò)靶向調(diào)節(jié)CAFs和腫瘤細(xì)胞協(xié)同作用，達(dá)到了優(yōu)越的治療效果。

圖4：經(jīng)由 Gemini-like NPs的化學(xué)抗性與TNBC的組合療法。

隨后，誘導(dǎo)T細(xì)胞記憶我們檢測(cè)了聯(lián)合遞送Gemini-like NPs治療小鼠的長(zhǎng)期T細(xì)胞記憶反應(yīng)。在單次給藥siNNMT - CAFs /EBN-4T1@Gel兩個(gè)月后，治愈小鼠接受4T1腫瘤細(xì)胞再攻毒(圖5a)。接種4T1細(xì)胞后，所有年齡匹配的小鼠均表現(xiàn)出腫瘤快速進(jìn)展，而在30天的時(shí)間窗口內(nèi)，只有一半的愈合小鼠出現(xiàn)腫瘤形成，生物發(fā)光信號(hào)明顯減弱，生長(zhǎng)明顯延遲(圖5b,c)。我們進(jìn)一步分析了腫瘤再接種三周后脾臟和腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞的中央記憶T (Tcm)細(xì)胞水平。與自然對(duì)照組相比，經(jīng)siNNMT-CAFS/EBN-4T1@Gel治療的小鼠CD8+和CD4+ Tcm細(xì)胞的比例均顯著增加(圖5d)。同樣，與自然對(duì)照組小鼠相比，siNNMT-CAFS/EBN-4T1@Gel-pretreated小鼠募集了更高水平的腫瘤浸潤(rùn)性CD8+和CD4+ T細(xì)胞(圖5e)。這些結(jié)果表明，雙子座樣NPs在誘導(dǎo)ofT細(xì)胞記憶中具有持久和有效的腫瘤再挑戰(zhàn)回憶反應(yīng)的強(qiáng)大能力。

圖5：誘導(dǎo)T細(xì)胞記憶。

隨后，我們繼續(xù)評(píng)估這種納米治療策略在其他類型的化療耐藥腫瘤中的適用性。為此，對(duì)H22型肝細(xì)胞癌(HCC)、Panc02型胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)和CT26型結(jié)直腸癌(CRC)的小鼠進(jìn)行了反復(fù)治療索拉非尼(SFN)、吉西他濱(GEM)和5-氟尿嘧啶(5-FU)在這些模型中獲得化學(xué)耐藥。成功誘導(dǎo)化療耐藥后，我們構(gòu)建了三種類型的Chemo-CC用于靶向遞送相關(guān)化療藥物，免疫組織化學(xué)分析表明，siNNMTCAFS@Gel或siNNMT- CAFs /GEM-Panc02@Gel均能有效降低Nnmt的蛋白水平，效果相似，而游離siNNMT和GEM (siNNMT/GEM)或GEM-Panc02@Gel治療沒(méi)有效果(圖6a)。此外，從siNNMT-CAFS@Gel或siNNMT-CAFS/GEMPanc02@Gel治療的腫瘤中分離的CAFs 中，NNMT、CAFS標(biāo)記物FAP- Rfs以及CAFs衍生的原癌細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)水平顯著下調(diào)(圖6b-d)。接下來(lái)，我們研究了CAFs重編程在CSC分化和免疫激活方面的后果。一劑量的水凝膠給藥siNNMTCAFS或聯(lián)合給藥Gemini-like NPs可顯著降低sfn耐藥HCC、gem耐藥PDAC和5- fu耐藥CRC中CSC群體的豐度(圖6e)。相比之下，CSCs的水平不受SFNH22@Gel、GEM-Panc02@Gel或5-FU-CT26@Gel的影響。在以上三種類型的腫瘤中，一劑ofsiNNMT-CAFS@Gel治療提高了腫瘤浸潤(rùn)性CD8+ T細(xì)胞的水平。因此，在這些類型的腫瘤模型中，共同遞送Gemini-like NPs顯示出對(duì)CD8+ T細(xì)胞募集的組合效應(yīng)(圖6e)。腫瘤內(nèi)共遞送游離siNNMT和化療藥物不會(huì)改變CSCs或浸潤(rùn)CD8+ T細(xì)胞的比例，驗(yàn)證了水凝膠遞送CAFS和癌細(xì)胞靶向NPs的優(yōu)勢(shì)。最后，我們監(jiān)測(cè)了單劑量雙子星樣NPs在這些耐藥腫瘤模型中的治療效果。在SFN耐藥的HCC中，腫瘤生長(zhǎng)不受卸載的Gel或游離的siNNMT/SFN的干擾，并且受到siNNMT-CAFS@Gel或SFN-H22@Gel的輕度限制。相比之下，通過(guò)siNNMT-CAFS/SFN-H22@Gel聯(lián)合治療可根除腫瘤(圖6f)。與腫瘤進(jìn)展一致，對(duì)照組或單一治療組的所有小鼠在癌細(xì)胞接種后48天內(nèi)死亡，而接受聯(lián)合治療的小鼠在我們的觀察窗口(60天)內(nèi)沒(méi)有死亡(圖6g)。

圖6：對(duì)化療耐藥的肝癌、胰腺癌和結(jié)直腸癌的適用性。

總之，在對(duì)各自的一線化療藥物耐藥的乳腺癌、肝癌、胰腺癌和結(jié)直腸癌小鼠模型中，單劑量水凝膠共同遞送Gemini-like NPs可以恢復(fù)化療敏感性，誘導(dǎo)免疫激活，并實(shí)現(xiàn)腫瘤消退。此外，它還能刺激強(qiáng)健的T細(xì)胞記憶，長(zhǎng)期具有抗腫瘤效果。因此，這項(xiàng)研究代表了一種具有廣泛適用性的創(chuàng)新方法來(lái)克服癌癥化療耐藥性。這些發(fā)現(xiàn)為開(kāi)發(fā)廣泛適用的癌癥化療耐藥策略提供了一個(gè)有希望的前景。

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37262365/