肌成纖維細胞中ASPP1的缺失通過減少p53的降解來減輕心肌纖維化

心臟纖維化是多種慢性和急性心血管疾病的典型病理特征。心臟纖維化的特征是心臟中膠原蛋白和其他細胞外基質（ECM）蛋白的過度產生和沉積。這種病理重構導致結構破壞和心肌功能障礙，最終損害心臟的機械、電和血管舒張功能。因此，闡明控制心臟纖維化的分子機制對于建立有效的治療策略至關重要。

p53蛋白（ASPP）家族的凋亡刺激蛋白是一組參與細胞凋亡調控的蛋白。其中，ASPP1和ASPP2通過增強p53的促凋亡功能激活p53介導的促凋亡基因轉錄，而iASPP的作用則相反。在之前的工作中，作者團隊發現ASPP1通過與p53結合，促進心肌凋亡，加重了缺血再灌注損傷后的心肌功能障礙。然而，ASPP1缺失可改善心功能，梗死面積減少，心肌細胞凋亡減少。在機制上，ASPP1促進了p53的核易位，并增強了促凋亡基因的轉錄。p53是抑制癌細胞增殖的典型腫瘤抑制因子。異常的成纖維細胞激活在生物學上類似于致癌性惡性腫瘤中不受限制的細胞增殖。腫瘤抑制因子p53也參與了肺和心臟纖維化的發展。有趣的是，初步發現，與ASPP1對心肌細胞p53活性的促進作用相比，它降低了心肌成纖維細胞中p53水平，增加了成纖維細胞增殖和膠原的產生。進一步研究ASPP1在梗死后心臟纖維化中的作用和分子機制。

去泛素化是一個可逆的泛素化過程，在調節蛋白定位和底物蛋白降解中起著至關重要的作用。該過程從修飾的底物中消除泛素分子。越來越多的證據表明，去泛素酶Otubain 1（OTUB1）調節許多與癌癥相關的信號通路，以促進腫瘤細胞的存活、增殖、侵襲性和耐藥性。已有報道指出，OTUB1可以去除p53中的泛素或多聚泛素，并增加p53的穩定性。

在本研究中，證實了ASPP1通過與OTUB1結合，增強p53的泛素化和降解，從而作為心肌纖維化的正調控因子。在肌成纖維細胞中抑制ASPP1可顯著減輕心肌纖維化。本文研究表明，靶向ASPP1在治療心臟纖維化中具有相當大的潛力。

ASPP1在心臟纖維化過程中表達上調

為了研究ASPP1在心臟纖維化中的潛在作用，首先檢測了其在慢性（4周）心肌梗死模型和TGF- β1處理的原代小鼠心臟成纖維細胞（PMCFs）中的表達變化。心肌梗死后4周，小鼠心臟梗死區ASPP1的mRNA和蛋白水平均升高。ASPP1在心肌梗死4周期間呈動態增加（圖1a，b）。同樣，在用TGF-β1處理的PMCFs中，觀察到ASPP1表達上調（圖1c，d）。

整體ASPP1缺失可減輕心肌梗死后的心肌纖維化

   在之前的研究中，使用CRISPR/Cas9策略生成了ASPP1常規敲除（KO）小鼠（C57BL/6背景）（7-8周齡，22-25 g）。ASPP1-KO小鼠出生后生長正常。采用ASPP1-KO小鼠，探討ASPP1在心肌梗死后心肌纖維化中的功能作用（圖2a）。心臟超聲心動圖的實驗設計和時間安排如圖2b所示。western blot檢測證實ASPP1的KO成功（圖2c）。

心肌梗死4周后，WT小鼠的死亡率為49%，而ASPP1-KO小鼠的死亡率降低至16%（圖2d）。超聲心動圖檢查顯示，WT和ASPP1-KO小鼠在基線時的收縮功能無差異。在心肌梗死后2周和4周，ASPP1的缺失顯著改善了心功能，這表明左心室射血分數（EF%）和縮短分數（FS%）增加（圖2e）。ASPP1缺失降低了心肌梗死后4周的心臟重量與體重（HW/ BW）和梗死面積的比值（圖2f，g）。值得注意的是，ASPP1 KO降低了ECM蛋白Col1、Col3和Fn1以及肌成纖維細胞標志物α-SMA和Postn的表達（圖2h，i）。這些數據表明，ASPP1缺失可以防止心肌梗死后的左心室不良重構。

肌成纖維細胞ASPP1的缺失限制了纖維化重構，并保留了損傷心臟的功能

由于ASPP1缺失對缺血損傷時的心肌細胞具有保護作用，上述ASPP1缺失對慢性心肌梗死的有益作用可能是由于心肌細胞中ASPP1缺失引起的。然后，使用他莫昔芬誘導的Postn啟動子驅動的MerCreMer轉基因（Postn^MCM）技術在肌纖維母細胞中生成條件性ASPP1缺失，以探索ASPP1對梗死后心臟重構的貢獻。將Postn^MCM小鼠與ASPP1^fl/fl小鼠雜交，獲得ASPP1^fl/fl Postn^MCM小鼠（圖3a）。心肌梗死術后給予他莫昔芬（TAM）ASPP1^fl/flPostn^MCM或ASPP1^+/+ Postn^MCM小鼠5天，誘導肌成纖維細胞（ASPP1）中ASPP1缺失，并進一步檢查（圖3b）。

在ASPP1-CKO小鼠中，ASPP1蛋白水平顯著下調（圖3c）。心肌梗死后4周，ASPP1-CKO小鼠的存活率明顯高于ASPP1^+/+Postn^MCM小鼠。這些發現證實了肌成纖維細胞中ASPP1的缺失可改善心肌功能，并防止心肌梗死后發生不良的心臟重構。

ASPP1在體外促進心臟成纖維細胞的活化和膠原蛋白的產生

為了評估ASPP1在體外成纖維細胞增殖、分化和ECM產生中的作用，通過轉染了ASPP1 siRNA到培養的pmcf中敲除其表達（圖4a）。ASPP1的沉默降低了TGF-β1處理的pmcf中的Col1和Fn1的mRNA和蛋白水平（圖4b-d）。EdU染色顯示，在TGF-β1處理的pmcf中，ASPP1沉默明顯抑制細胞增殖（圖4e）。然后，采用流式細胞術檢測各細胞周期階段的DNA含量，以評估PMCFsf的增殖狀態。ASPP1敲低導致細胞周期阻滯在G0/G1期，在TGF-β1處理的PMCFs中，S期細胞從29.07%減少到15.83%。S1a)。免疫熒光染色顯示，在TGF-β1處理后的PMCFs中，α-SMA陽性細胞的數量顯著減少（圖4f）。

然后，在培養的PMCFs中過表達ASPP1（圖4g）。與預期的一樣，過表達ASPP1增加了Col1和Fn1的mRNA和蛋白水平（圖4h-j）。過表達ASPP1促進成纖維細胞增殖，更多的EdU陽性細胞證明了這一點。同時，流式細胞術結果顯示，ASPP1過表達組有29.6%的細胞處于S期，對照組有19.6%的細胞處于S期。(圖4k和S1b)。此外，與對照組相比，ASPP1過表達組的α-SMA陽性細胞率顯著升高（圖4l）。

ASPP1在心臟成纖維細胞中調節p53信號通路

由于p53在成纖維細胞激活和心臟纖維化中至關重要，作者推測ASPP1可能通過影響p53來調節心臟纖維化。心肌梗死后4周，ASPP1的整體和肌成纖維細胞條件性KO均顯著恢復了梗死區p53蛋白水平（圖5a）。ASPP1的下調顯著上調了TGF-β1處理的PMCFs中的p53水平，而過表達ASPP1顯著抑制了PMCFs中p53的表達（圖5b）。然而，p53在ASPP1上調和下調作用中的mRNA水平沒有明顯影響（圖5c），在ASPP1整體KO小鼠和肌成纖維細胞KO小鼠中沒有差異(圖。S2a, b)。此外，心肌梗死小鼠ASPP1或ASPP1沉默的肌成纖維細胞KO顯著促進有絲分裂細胞周期蛋白Ccna2、Ccnb1、Ccne1和Cdk1的表達，并抑制Cdk1抑制劑Cdkn1a的表達(圖。5d和S2c，d)。當ASPP1過表達時，可以觀察到相反的作用（圖5e）。值得注意的是，除了參與細胞周期的p53外，ASPP1的干擾對其他經典靶基因沒有顯著影響(圖。S2e, f)。免疫熒光研究顯示，在TGF-β1處理的PMCFs中，下調ASPP1導致p53的上調和核積累（圖5f），而過表達ASPP1顯著降低了p53的總水平和核水平（圖5g）。此外，還進一步研究了ASPP1在纖維化中的生物學功能是否依賴于p53。發現，在TGF-β1處理的PMCFs中，下調p53顯著抑制了抑制ASPP1對Col1和Fn1表達的抑制作用（圖5h）。抑制p53可通過敲除ASPP1進一步促進細胞增殖，恢復細胞增殖和有絲分裂細胞周期蛋白基因的表達(圖。S3c, d.此外，p53的過表達消除了ASPP1對PMCFs中Col1和Fn1表達的促進作用（圖5i）。此外，p53的過表達降低了成纖維細胞的增殖率，并改變了ASPP1誘導的細胞周期相關基因的表達。(圖S3e, f)。p53的敲除和過表達效率如圖S1a, b所示。

接下來，研究了ASPP1對p53蛋白穩定性的影響機制。使用環己酰亞胺檢測了p53的半衰期。抑制ASPP1延長了p53的半衰期，過表達ASPP1縮短了p53的半衰期 (圖S4a, b)。用蛋白酶體抑制劑MG132處理PMCFs可抑制ASPP1過表達誘導的p53下調（圖6a），表明ASPP1可能通過泛素-蛋白酶體途徑調控p53的降解。然后，對TGF-β1處理過的PMCFs進行了共免疫沉淀（co-IP）和質譜（MS）分析，以篩選與ASPP1結合并具有調節p53泛素化和降解潛力的蛋白（圖6b）。共鑒定出2526個蛋白。KEGG分析顯示，許多蛋白質參與了蛋白質的折疊和降解，其中包括去泛素化酶OTUB1，據報道它可以調節p53的降解19。隨后，驗證了ASPP1抗體在TGF-β1處理的TGF中沉淀了OTUB1，反之亦然（圖6c）。OTUB1基因的沉默抑制了ASPP1基因下調導致的p53基因的上調（圖6d）。OTUB1的敲除效率如圖所示。S5a.此外，過表達OTUB1完全恢復了ASPP1處理后的PMCFs中p53的表達（圖6e）。OTUB1的過表達效率如圖S5b所示。這些數據表明，OTUB1介導了ASPP1對p53蛋白水平的調控。

討論

ASPP1通過促進BAX表達，抑制Bcl2表達，抑制細胞凋亡，抑制腫瘤生長速率。在心臟缺血-再灌注損傷中，ASPP1促進心肌細胞凋亡，嚴重損害心功能。與ASPP1在癌細胞和心肌細胞中的促凋亡作用不同，在本研究中發現了ASPP1促進心肌成纖維細胞增殖和促進心肌纖維化發展的有趣能力。ASPP1通過轉運到細胞核激活p53或p53家族成員，選擇性發揮促凋亡作用，增強p53下游22的促凋亡基因的轉錄。在本研究中，發現ASPP1負調控心臟成纖維細胞中p53蛋白水平。

值得注意的是，p53在心肌纖維化的發生發展中起著至關重要的作用。在心肌纖維化過程中，它通過其細胞周期阻滯功能來抑制成纖維細胞的增殖，從而抑制心肌纖維化的進展。p53抑制細胞周期在G1/G0期和阻止其進入S期，抑制細胞增殖。發現ASPP1促進心臟成纖維細胞增殖和纖維化，這可以通過其對心臟成纖維細胞中p53的負調控來解釋。p53主要作為細胞核中的轉錄因子，通過直接調節靶基因的表達來發揮其影響。在缺血-再灌注損傷中，p53通過調節Bcl2和Puma積累并誘導心肌細胞凋亡。另一方面，PAI-1通過提高p53的表達，進而激活p53-p21-rb細胞周期抑制通路，從而誘導纖維化肺疾病中的肺泡2型細胞衰老。ASPP1通過調節p53來控制細胞功能。當RAS被激活時，ASPP1積累并驅動p53和p53家族成員到細胞核，增強p53的轉錄和凋亡功能。在心臟缺血/再灌注（I/R）損傷中，ASPP1和p53的相互作用導致它們通過輸入蛋白-β1同時易位到細胞核中，最終促進心肌細胞凋亡。在本研究中，發現在心臟成纖維細胞中，ASPP1可以抑制p53并增強成纖維細胞的增殖。ASPP1的缺失促進了p53的核定位，而p53核定位的積累顯著抑制了纖維化的進展。由于ASPP1對p53表達的相反調控，可以觀察到ASPP1在不同細胞類型中的相反的生物學效應。例如，ASPP1增加心肌細胞p53水平，誘導細胞凋亡。

已經證明，相同的分子或途徑可能在不同的細胞或組織類型中發揮不同的或相反的生物學功能。據報道，泛素特異性肽酶7（USP7）通過在細胞過程中與p53相互作用而產生多種功能。USP7通過直接穩定p53來促進結直腸癌細胞凋亡。然而，USP7通過與小鼠結合并穩定MDM2，誘導成纖維細胞激活和心肌纖維化，從而導致p53降解。之前曾報道過，p53通過上調Puma、Bax和Noxa來促進心肌細胞凋亡，從而加重了缺血-再灌注損傷。有趣的是，在本研究中，p53主要上調Cdkn1a，抑制細胞周期進程，最終導致細胞周期阻滯而不是凋亡，從而防止心臟成纖維細胞的異常增殖，減輕心臟的負擔。發現提供了一個新的見解，ASPP1是心臟纖維化的新監管機構，而且，更重要的是，同樣的基因操作策略沉默ASPP1，抑制心肌細胞而促進成纖維細胞，可以產生心臟保護作用反映在減少心肌纖維化和通過p53表達的差異調節機制增加心肌細胞的生存。不同的細胞或組織表現出不同的生物學功能和對刺激/應激的反應，這主要依賴于不同的細胞特異性成分和信號通路。細胞/組織對一種刺激的不同反應在臨床研究和治療中具有重要的潛力和意義。

p53的泛素化修飾是改變其蛋白水平的一個關鍵的翻譯后修飾。去泛素化修飾是一種泛素化的可逆機制，它持續控制蛋白質水平，維持體內蛋白質穩態。先前的研究表明，去泛素化蛋白酶USP9X參與了與MDM2的相互作用，MDM2是p53中經典的E3泛素連接酶，可誘導MDM2的積累，從而導致p53的泛素化和降解。OTUB1通過與p53的相互作用作為一種去泛素化酶。OTUB1直接抑制細胞質中p53的泛素化，穩定和激活p53，誘導p53依賴的凋亡和劇烈的細胞生長抑制。在本研究中，發現大量的ASPP1限制了p53與OTUB1之間的相互作用，最終導致p53的泛素化和降解。

心肌梗死后，心肌成纖維細胞經歷表型從靜止狀態的表型轉換。這些活化的CFs或肌成纖維細胞在愈合階段和膠原沉積中發揮重要作用，導致。肌成纖維細胞的豐富存在導致ECM積累導致纖維化，這大大增加了發病率和死亡率。在這里，發現心肌梗死發病后ASPP1的肌成纖維細胞KO對小鼠心肌纖維化的進展有很強的抑制作用。抑制肌成纖維細胞中ASPP1的表達可顯著改善心肌梗死后的心肌功能和減少梗死面積。本研究采用PostnMCM策略刪除ASPP1，從而顯著減輕心肌纖維化。然而，Postn也在其他類型的細胞中表達，如血管平滑肌細胞、內皮細胞等。因此，不能排除這些細胞對ASPP1缺失反應的心臟保護的潛在貢獻。因此，ASPP1是心肌梗死后心肌纖維化在臨床實施中的潛在治療靶點。

研究結果顯示，在心肌細胞和心肌成纖維細胞中抑制ASPP1對小鼠的心功能都產生了有益的影響。因此，抑制ASPP1可能是預防心肌梗死或減少缺血-再灌注損傷的良好策略。目前，除了siRNA或shRNA外，目前還沒有針對ASPP1的小分子抑制劑。抑制ASPP1可以通過利用蛋白水解靶向嵌合體（PROTAC）技術來特異性地降低成纖維細胞和心肌細胞中ASPP1的表達來實現。

p53穩定劑的應用，如nutlin MDM2抑制劑，可以阻止p53的降解，并導致心肌細胞和肌成纖維細胞中p53蛋白的增加。可以推測，p53抑制成纖維細胞活性可以抑制心肌纖維化，而p53的促凋亡功能可能通過p53促進心肌細胞凋亡。然而，抑制ASPP1可能通過增加肌成纖維細胞中的p53來抑制纖維化，并通過減少p53和心肌細胞凋亡來減輕心臟損傷。因此，抑制ASPP1對成纖維細胞和心肌細胞都產生有益的作用，這可能是比僅抑制MDM2抑制劑nutlin抑制p53降解更好的策略。然而，這還需要用實驗數據來證明。

盡管有這些有趣的發現，但這項研究仍有一些局限性。首先，證實了ASPP1通過與OTUB1的相互作用負調控p53的穩定性，而不能排除其他蛋白參與了這一過程。其次，證實了抑制ASPP1具有抗纖維化作用。然而，并沒有發現一種能抑制心臟纖維化的ASPP1特異性抑制劑。最后，ASPP1在心臟纖維化中如何升高的具體機制以及它如何促進成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化的具體機制仍有待進一步研究。綜上所述，研究表明，ASPP1在病理性心肌纖維化的發生發展中起著至關重要的作用。抑制ASPP1可減輕心肌梗死患者的心功能障礙，預防心臟纖維化。ASPP1和OTUB1之間的相互作用促進了p53的泛素化和隨后的降解，從而促進了心臟成纖維細胞的激活和心肌纖維化的發展。這些發現為病理性心肌纖維化的分子機制提供了獨特的見解，并為心肌纖維化提供了新的治療策略。

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