AM: 腫瘤細胞內多胺耗竭誘導增強型細胞焦亡與銅死亡用于癌癥免疫治療

腫瘤細胞中多胺的過表達有助于建立免疫抑制微環境，促進腫瘤生長。該研究巧妙地設計了一種基于銅、白皮杉醇和透明質酸的多功能納米材料(Cu-Pic/HA NPs)，通過抑制多胺合成，消耗細胞內多胺，損害多胺攝取，有效地引起細胞內總多胺的消耗，從而增強焦亡和銅死亡，并激活強大的免疫反應，達到抗腫瘤治療的目的。細胞內整體多胺耗竭導致線粒體功能障礙，不僅導致線粒體內銅離子激增，從而引起有毒蛋白聚集誘導銅死亡，還會觸發線粒體內活性氧(ROS)的積累，進而上調zDHHC5和zDHHC9的表達，促進氣真皮蛋白D (GSDMD)和GSDMD- N的棕櫚酰化，最終誘導焦亡增強。這種通過綜合多胺耗竭增強焦亡和銅死亡的治療策略，有助于重塑免疫抑制的腫瘤微環境，從而激活抗腫瘤免疫應答，最終有效抑制腫瘤的生長和轉移，為癌癥免疫治療提供了一種新的模板。

方案一：Cu-Pic/HA NPs造成腫瘤細胞內多胺全面耗竭從而誘導增強型細胞焦亡和銅死亡并激活抗腫瘤免疫治療的示意圖。

Cu-Pic 納米顆粒采用一鍋法合成，并進一步用 HA 修飾以獲得 Cu-Pic/HA NPs。圖 1a 中的 TEM 圖像表明 Cu-Pic/HA NPs 表現出單分散的柳葉形態。X 射線光電子能譜 （XPS） 分析證實 Cu-Pic/HA NPs 中存在 Cu、C、N 和 O 元素（圖 1b）。通過圖 1c 中 Cu 2p 的高分辨率光譜擬合，934.9/954.8 和 932.5/952.4 eV 處的峰歸因于 Cu²⁺和 Cu⁺（混合價銅）。高角度環形暗場掃描透射電子顯微鏡（HAADF-STEM） 圖像以及能量色散光譜儀 （EDS） 光譜進一步證明了 Cu-Pic/HA NP 內 Cu 和 O 元素的均勻分布（圖 1d，e）。傅里葉變換紅外光譜 （FT-IR） 結果證明，酚類 O-H 拉伸峰在 3512 和 3421 cm^?1 處的強度降低對于 Cu-Pic/HA NPs，而對應于 846 cm^?1 的 Cu-O 拉伸振動帶顯著增加（圖 1f）。此外，Cu-Pic/HA NPs 在 1576 cm^?1處表現出擴大的 C-O 拉伸振動帶，表明 HA 成功涂覆在材料表面。當在合成的每個階段測量 Cu-Pic/HA NPs 的 Zeta 電位時，與 Cu-Pic 納米顆粒相比，相應的值從正變為負（圖 1g），進一步證明 HA 成功封裝了納米顆粒的表面。在 HA 的保護下，Cu-Pic/HA NPs 可以在水溶液、PBS 溶液和 10% FBS 培養基中保持穩定 7 天（圖 1h）。隨后的研究集中在模擬 TME 中 Cu-Pic/HA NPs 的降解。如圖 1i 所示，當暴露于 pH 值為 6.5 的溶液中 4 h時，Cu-Pic/HA NPs 具有完整的材料形態。然而，當暴露于 pH 5.5 相同時間時，發生快速降解。這種現象歸因于 Cu-Pic/HA NPs 內配位鍵的固有不穩定性。此外，Cu-Pic/HA NPs 在 GSH 和 H₂O₂ 條件下表現出更劇烈的降解，可能是因為 Cu⁺/Cu²⁺可與 GSH 和 H₂O₂ 反應，導致材料快速降解。Cu-Pic/HA NPs 的生物降解性為進一步研究其抗腫瘤機制提供了有價值的見解。

圖1：Cu-Pic/HA NPs的合成與表征

采用硝基藍四唑（NBT） 作為指標評估 Cu-Pic/HA NPs 的 SOD 樣活性。L-蛋氨酸和核黃素在紫外線照射下可產生 O₂^??將 NBT 還原為藍色蛋氨酸，在 560 nm 處具有明顯的特征吸光度峰。其吸光度強度隨著 Cu-Pic/HA NPs 濃度的增加而逐漸降低（圖 2b），證明 Cu-Pic/HA NPs 具有良好的 SOD 樣活性。此外，Cu-Pic/HA NPs 表現出類似 CAT 的活性，即它們可以分解 H₂O₂為 O₂（圖 2c）。這使得納米材料能夠改善 TME 中的缺氧條件，并為抑制多胺的攝取提供支持。Cu-Pic/HA NPs 的 POD 樣活性通過 3， 3， 5， 5-四甲基聯苯胺 （TMB） 的顯色實驗得到驗證。當不同濃度的 Cu-Pic/HA NPs 與H₂O₂混合時，溶液的吸光度顯示濃度依賴性顯著增加（圖 2d）。此外，發現 TMB 的顯色效果在與 Cu-Pic/HA NPs 和 H₂O₂時間有關（圖 2e），從而證實了 Cu-Pic/HA NPs 的良好 POD 樣活性。此外，TMB 的顯色反應也滿足典型的 Michaelis-Menten 動力學方程（圖 2f）。隨后，此外，Cu-Pic/HA+ H₂O₂組顯示出比 Cu ²⁺+ H₂O₂組強得多的ROS生產能力，為后續的抗腫瘤研究奠定了堅實的基礎。眾所周知，GSH 通常是過表達的內源性抗氧化劑，以穩定腫瘤細胞中的氧化還原平衡。在這里，使用 GSH 檢測試劑 5,5'-二硫雙比（2-硝基苯甲酸）（DTNB） 確定 Cu-Pic/HA NPs 對 GSH 的消耗能力。Cu-Pic/HA NPs 處理溶液在 415 nm 處的特征峰表現出顯著的濃度和時間依賴性下降趨勢（圖 2g，h）。此外，Cu-Pic/HA NPs 和 GSH 之間的清除反應遵循 Michaelis-Menten 動力學方程（圖 2i），這些發現明確證實了 Cu-Pic/HA NPs 具有的特殊 GSHOx 樣活性。

圖2：Cu-Pic/HA NPs的多種酶模擬活性以及多胺的氧化

接下來，首先評估了4T1細胞對羅丹明b標記的Cu-Pic/HA NPs的內吞作用。與4T1細胞孵育4小時后，觀察到明顯的紅色熒光(圖3a)，證實了4T1細胞成功內化了Cu-Pic/HA NPs。隨后，進一步追蹤納米材料在細胞內的運輸路線。為了實現這一目標，使用羅丹明b標記的Cu-Pic/HA NPs和LysoTracker Green標記進行了溶酶體共定位研究。當孵育時間小于4 h時，綠色熒光(溶酶體)和紅色熒光(羅丹明B)之間存在明顯的共定位(圖3b)，驗證了Cu-Pic/HA NPs有效內化到溶酶體中。共孵育4 h后，綠色熒光強度逐漸減弱，與紅色熒光重疊效應減弱，說明溶酶體的正常功能受到影響。溶酶體是細胞內重要的細胞器，不僅具有基本的分解功能，而且在多胺運輸系統中起著重要的作用。如圖3c所示，與其他組不同，Cu-Pic/HA NPs組的ATP13A2表達水平明顯降低。與Cu²⁺組相比，Cu-Pic/HA NPs可以通過內吞作用進入細胞溶酶體，在酸性條件下釋放大量銅離子，導致溶酶體滲透壓失衡，最終導致溶酶體功能障礙。因此，Cu-Pic/HA NPs通過引起溶酶體功能障礙來降低ATP13A2的表達。此外，溶酶體功能的損傷降低了ATP13A2的表達，從而阻礙了細胞內多胺的有效運輸(圖3d)。

腫瘤細胞對多胺攝取能力的損害是實現細胞多胺完全消耗的關鍵一步。WB實驗顯示Cu-Pic/HA NPs組HIF-α表達較Cu²⁺組降低，進一步證實缺氧情況得到緩解(圖3c)。這些結果足以解釋Cu-Pic/HA NPs可以改善4T1細胞的缺氧環境，從而降低細胞多胺攝取能力(圖3d)。隨后，利用2′，7′-二氯熒光素(DCFH-DA)作為熒光探針，檢測Cu-Pic/HA NPs在腫瘤細胞中產生ROS的能力。如圖3e、f所示，Cu-Pic/HA NPs組的綠色熒光最明顯，證明Cu-Pic/HA NPs可以催化TME中的 H₂O₂產生大量ROS。利用O₂^??探測探針雙氫乙錠(DHE)進一步證實了細胞內ROS的積累。與上述結果一致，Cu-Pic/HA NPs組的紅色熒光最弱(圖3g)，證明納米材料進入癌細胞后可以誘導大量ROS生成。此外，還利用GSH檢測試劑盒評估了納米材料對腫瘤細胞的GSH清除能力。與其他組不同，Cu-Pic/HA NPs組細胞內GSH水平明顯降低，如圖3h所示，表明Cu-Pic/HA NPs對細胞內GSH的清除速度很快。圖3j所示的免疫熒光圖像證實，與其他組相比，Cu-Pic/HA NPs組的綠色熒光強度明顯減弱，反映了Arg 2酶活性的明顯抑制。重要的是，ROS的上調也導致了細胞多胺含量的降低。因此，采用多胺檢測試劑盒檢測細胞中多胺的含量。幸運的是，與其他組相比，Cu-Pic/HA NPs組顯示細胞多胺顯著減少(圖3k)，證實Cu-Pic/HA NPs有效地消耗了細胞內的多胺并破壞了細胞氧化還原平衡。總之，如圖3j所示，Cu-Pic/HA NPs可以抑制細胞內多胺的合成，消耗細胞內多胺并阻斷多胺的攝取，從而完全消耗細胞內多胺。

圖3：細胞內多胺全面耗竭的機制。

隨后，探討了納米材料的抗腫瘤治療效果。將腫瘤大小≈100 mm³的4T1荷瘤BALB/c小鼠隨機分為4組，按不同時間間隔靜脈注射3次(圖4a)。由于Cu-Pic/HA NPs包被HA，可以有效識別腫瘤細胞高表達的CD44，具有良好的腫瘤靶向效率。與其他組的腫瘤生長速度相比Cu-Pic/HA NPs組的腫瘤生長速度甚至逐漸減慢(圖4b、c)，這是因為Cu-Pic/HA NPs通過引起細胞內多胺的整體耗竭，在體內激活免疫反應，誘導了細胞內的熱沉和銅死亡的增強(圖4d)。腫瘤組織H&E、TUNEL染色結果表明Cu-Pic/HA NPs組表現出最明顯的核收縮和染色質凝聚，可以有效殺傷腫瘤細胞(圖8e)；肺組織照片和H&E切片顯示轉移結節的存在最少(圖4f)，證實Cu-Pic/HA NPs可以有效地誘導體內免疫反應并維持免疫記憶以抑制腫瘤復發和轉移。此外，Cu-Pic/HA NPs組小鼠的體重保持相對穩定，而腫瘤重量明顯減少(圖4g)。Cu-Pic/HA NPs組精胺和亞精胺水平均顯著降低，與通過細胞內總多胺耗竭，誘導細胞焦亡和銅死亡，具有良好的抗腫瘤治療作用。

圖4：抗腫瘤治療效果。

綜上所述，該研究成功地設計和合成了Cu-Pic/HA NPs，通過全方位的細胞內多胺消耗來促進焦亡和銅死亡，從而有效地抗腫瘤治療。Cu-Pic/HA NPs具有多種酶活性，不僅可以產生豐富的ROS，還對Arg2活性也有抑制作用，從而抑制多胺合成途徑，通過增加多胺消耗和減少多胺攝取來實現細胞內多胺的總消耗。多胺的完全耗盡，一方面可能導致線粒體功能障礙和ATP供應不足，導致毒性蛋白聚集，引發銅死亡。另一方面，可激活Caspase-1/GSDMD通路，上調GSDMD的s -棕櫚酰化，誘導焦亡增強。DAMPs的釋放進一步增強了體內免疫應答，顯示出顯著的抗腫瘤治療效果。這種由細胞內整體多胺耗竭引起的增強焦亡和銅死亡的治療策略為癌癥免疫治療提供了一個新的切入點。

原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.202409066#adma202409066-fig-0001